疟疾的实验诊断

  疟疾(malaria)是由疟原虫寄生于人体、经媒介按蚊传播。主要经疟蚊叮咬或输入带疟原虫患者的血液而感染。疟原虫寄生于人体红细胞和肝细胞中，引起疟疾，是我国重要寄生虫病之一。寄生于人体的疟原虫有四种，即间日疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫，分别引起间日疟、恶性疟、三日疟和卵形疟。在我国主要以间日疟原虫和恶性疟原虫为常见，其他两种少见，偶可见国外输入的一些病例。疟疾呈世界性分布，主要流行于非洲、东南亚及中美洲等国家。我国以云南、海南等地区流行较为严重。

    【临床表现】

    疟疾的临床表现主要以周期性发冷、发热、出汗等症状和脾大、贫血等体征为特点的寄生虫病。

    【实验诊断】

    实验室检测主要是根据疫区住宿史、典型临床症状与体征、如定期发冷、发热、出汗、脾大等，以及病原学检测、血清免疫学检测等结果诊断。

    一、病原学检测

    1．血涂片检测  血液涂片镜检，迄今仍是最可靠的确诊疟疾方法，如发现红内期疟原虫即可确诊。

    主要采用血涂片吉瑞氏染色，以检测厚血膜为主。薄血膜主要用于虫种鉴别和原虫密度计数。染色后疟原虫核呈红色，胞质蓝色。

    【评价】

    此法费时且检出率较低。除环状体外，其他各期疟原虫均可见褐色疟色素。现症患者至少检测100个厚血膜视野，带虫者应查完整个厚血膜，未发现疟原虫判为阴性。以薄血膜中平均每100个红细胞中原虫数或厚血膜平均每100个白细胞范围内原虫数，推断每微升血中原虫密度。厚血膜法的敏感性可达每微升血10～20个原虫。

    2．血沉棕黄层定量法(quantitative buffy coat，QBC)  因为感染红细胞轻于正常红细胞，用毛细管吸附吖啶橙及抗凝剂后进行血样采集，经离心，感染红细胞位于正常红细胞与棕黄色素层之间，提高检出率。且因原虫胞质被染成橘黄色，易于观察。

    【评价】

    该法与传统厚血膜法比较，其敏感性至少提高8倍，特异性可达98.4%，可用于疟疾监测及献血者的疟疾检测。缺点是费用高、操作繁琐，且难以进行原虫计数及鉴别虫种。

    3．苯并羧基嘌呤  (benzothio carboxy purine，BCP)荧光染色法  是用苯并羧基嘌呤染血膜，荧光显微镜观察。疟原虫各期的形态与吉瑞氏染色相同，滋养体、裂殖体、配子体均呈苹果绿色荧光，疟色素呈黄色，胞核为墨绿色。

    【评价】

    该法与吉瑞氏染色镜检相比，具有较高的敏感性及阳性预测值，且操作简便、染色稳定，不易与杂质混淆，且不受血涂片质量、原虫密度及虫期的影响，适合于现场应用。

    二、免疫学检测

    1．血清抗体的检测  目前检测疟原虫抗体的方法主要有酶联免疫吸附法(ELISA)和间接荧光抗体实验(IFA)。

    【评价】

    ELISA操作便捷、费用低廉，可快速处理多组样品并半定量，且结果重复性好，故广泛应用于疟疾的免疫诊断。特别是以基因工程方法制备的抗原易于纯化和标准化，使其敏感性和特异性均提高。斑点免疫酶联试验(dot-ELISA)简化了常规ELISA的操作步骤，且可用肉眼判断结果，较为简便。用dot-ELISA、ELISA和FIA检测镜检确诊的恶性疟患者血样，阳性符合率分别为96.2%、83.0%和79.2%，说明在检测恶性疟原虫特异性抗体时，dot-ELISA敏感率最高。

    FIA操作简便，敏感性及特异性均高。取阳性血样制成半厚血膜，加待测血清，再加异硫氰酸荧光素(FITC)标记的二抗，反应后洗涤，荧光显微镜观察。若血清中疟疾抗体阳性，则可见发黄绿色荧光的抗体。因疟原虫抗体在患者体内存留时间较长，故不能作为疟疾现症感染的依据。

    2．抗原检测  可查出原虫血症患者，对临床诊断为现症病人以及从人群中筛查传染源、观察疗效均有重要价值。检测抗原可以判断被检测者是否有活动性感染。

    常用的方法有：琼脂扩散法、放射免疫法(RIA)等。目前使用最多的是ELISA，包括抑制性ELISA(IELISA)、双抗体夹心ELISA、dipstick等。IELISA法的原理同固相放射免疫抑制实验，但以酶显色系统代替放射性核素，以抗体抑制率作为阳性判断标准。双抗体夹心ELISA的敏感性可达5个虫／106红细胞。

    (1)检测富组氨酸蛋白(HRP-Ⅱ)抗原：在临床及现场研究中，鉴别疟原虫虫种极为重要。它关系到治疗方法、药物选择及预后的差异。恶性疟原虫在红细胞期内能够合成、分泌可溶性的蛋白质-富组氨酸蛋白，其组氨酸含量超过70%，通过特异性的单抗检测疟原虫HRP-Ⅱ，可判断体内是否感染恶性疟原虫。