普洛斯创始人许明炎：基因测序市场是否还有机会？

　　5月25日晚8点，深圳市海普洛斯生物科技有限公司创始人许明炎与群友们分享基因测序市场的心得。基因测序市场火热，但是上游测序仪及试剂基本已寡头垄断，国内创业公司在上游技术及产品上到底还有没有机会?在基因领域的创业者又该注意哪些?以下是来自的许总的精彩分享。

　　本次分享一共从以下6个方面讲述：

　　1、各种分子检测技术

　　测序是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。Sanger测序是针对已知致病基因的突变位点设计引物，进行PCR 扩增直接测序。单个突变点的扩增(包括该位点在内的外显子部分片段的扩增)，不必将该点所在基因的全部外显子都扩增。所以单基因或部分基因控制的疾病样本检测，Sanger测序可以发挥精准和成本低的优势。通过将待测样本的序列与已知标准样本序列比较，寻找突变信息。

　　一代测序一次只能检测一个基因的某个片段中的已知位点，灵敏度较低，对待测样本量的需求较大。

　　相对一代测序而言，二代测序可以同时检测数十至数百个基因，并且可以探测到许多未知位点的信息，灵敏度高达99.99%并且需要的起始样本量只需几十纳克。二代测序的核心思想是变合成边测序，不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。通量高，相对于一代测序针对单个基因的检测，大大降低了测序的成本。

　　微滴式数字PCR系统在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成数万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后，对每个微滴的荧光信号进行逐一分析，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。其灵敏度高达0.001%，能克服核酸降解的不利影响，非常适合稀有样本中核酸的精确检测。

　　多种测序技术的对比，临床金标准qPCR一次只能针对一个已知位点进行检测，而一代测序可以同时检测多个位点。芯片技术和二代测序的通量都非常高，可以同时检测多个基因的多个位点，但是芯片技术的敏感度和准确性都远不及二代测序。

　　用一个成语来比喻测序技术就是“守株待兔”，那么不同的技术和平台有各自的特点。qPCR就是守着已知的位点等着兔子撞上来，而一代测序同时守着数百树桩，但是只能抓住已知的几只兔子。二代测序和芯片的工作量就大很多了，检测的位点从百万到上亿，二代测序更是会产生突破性的创新，发现以前未知的突变信息。

　　这个图表总结了各种检测技术的灵敏度和准确率。如果需要检测的对象是20%-50%的变异，例如临床用的组织样本，切片50%以上都是肿瘤细胞，那么利用一代测序就可以完成这个工作。如果肿瘤细胞含量较少的组织，穿刺或者胸水，可以使用ARMS法或者二代测序法，可以检测5%的肿瘤细胞。ctDNA的含量低于1%时，就需要用核心技术来降低测序错误和PCR扩增产生的错误，减少假阳性的发生。

　　2、NGS和液体活检临床应用

　　ctDNA的特点：

　　ctDNA在大多数肿瘤中能被检出

　　ctDNA水平在早期和晚期肿瘤(各种癌症)差异明显

　　比蛋白生物标识更加敏感、特异性高

　　检出率：转移性 > 非转移性

　　癌症分期越晚，检出率越高

　　ctDNA全面反映肿瘤基因突变，克服异质性

　　肿瘤进化追踪

　　目前对于肿瘤的进化追踪，相关研究还是挺多的，不同部位的癌细胞其变异程度是不一样的，根据变异DNA的相似程度从而像进化树样可以描绘出疾病的发展变化。

　　肿瘤异质性评估

　　在肿瘤发展的不同阶段会出现不同的细胞克隆，对其分别进行采样分析会发现有不同的DNA出现。血液样本中ctDNA含有的随机突变反映了肿瘤单克隆群的不同大小和活性，并揭示出肿瘤异质性变化的顺序。

　　3、HaploX的研究及其进展

　　截至目前HaploX已经收录了20个经典数据库，包含了50000种以上药物反应的数据，并且可以将87%以上的癌症进行分类，HaploX可以100%地将小细胞肺癌和非小细胞肺癌进行分型。数据库里有3000多个患者的数据，1000多份报告以及4000里样本数据，这些数据量高达60T。

　　4、基因测序技术的发展趋势

　　目前市面上主要的基因测序平台，进口的测序仪占领了90%以上的市场，其中以Illumina为主。

　　接下来简单介绍一下一些测序技术：

　　三代测序分为单分子测序技术和纳米孔技术。相对于二代测序，三代测序大大增加了测序的读长，但是测序产生的错误率较高，目前仍是阻碍单分子测序发展的阻力。Pacific Biosciences公司的SMRT技术也是基于边合成边测序的思想，与单分子测序仪不同的是，该方法以SMRT芯片为测序载体进行测序反应。另外值得注意的是，与其他方法不同，该方法中荧光标记的位置是磷酸基团而不碱基，再根据荧光的种类就可以判定dNTP的种类。此方法使得荧光强度变大而易于检测。SMRT技术实现了速度快的特性，对大量基因的测序有重大意义。

　　5、NGS临床专家共识、如何产品化

　　今年3月在第十三届中国肺癌高峰论坛上，吴一龙教授发布了液体活检和二代测序步入学术共识：

　　共识一

　　精准医学是一项系统工程，包括：

　　发现具有临床意义的基因异常：包括可靶点抑制、预测和/或预后标志物

　　发明可靶向特异基因异常的药物

　　寻找证明其特异的有效性安全性证据

　　应用于临床证明了证据的可重复性

　　任何一项的缺失都不允许。

　　共识二

　　液体活检是一项富有挑战性的新技术，在精准医学中扮演着越来越重要的角色。

　　液体活检的检测对象包括：循环肿瘤细胞、血浆 DNA、Exosome

　　液体活检的检测技术包括：ARMS(包括 superARMS)、ddPCR(包括 BEAMing)、NGS

　　共识三

　　检测已知的、单个临床可药物抑制的靶点，液体活检技术推荐ARMS方法;

　　检测已知的、多个平行临床可药物抑制的靶点，液体活检技术推荐 NGS 方法。

　　共识四

　　用于发现未知基因，探索疗效监测、预后判断和发现耐药机制等，液体活检技术建议使用 NGS。

　　6、国内创业者的机会

　　随着基因测序技术的发展，基因检测的费用的降低，基因检测应用到越来越多的生活场景中。这张图概括了目前基因检测的8大应用领域，分别是生殖健康，单基因遗传病，肿瘤个体化诊疗，农林渔业的科研，心脑血管等慢性疾病，个性化药物研发，消费性产品以及健康管理等方面。

　　二代测序的临床应用分为四大块，试管婴儿，无创产检，单基因遗传病以及癌症的精准治疗。其中肿瘤诊断成为最具潜力的应用市场，Illumina公司预测基因测序全球总市场容量为200亿美元，其中肿瘤诊断占比60%。同时，麦肯锡预测基因测序技术在肺癌、肠癌、乳腺癌和前列腺癌等领域的渗透率将高于20%。

　　基因测序市场还是有很大的机会，创业者只要找准一个方向，踏踏实实的做，就很容易和别人形成差别。

　　互动环节

　　Q： NGS跟数字PCR技术的结合点以及主要的应用在哪里?

　　许：NGS跟数字PCR是一个比较互补的技术。NGS用在液体活检里面可以检测到很多点，但是灵敏度不如数字PCR高。数字PCR是针对一些已知的点进行检测，数据通量很小，但灵敏度高。所以在临床未来的运用，我认为是先用NGS检测出变异的点，再用数字PCR针对性的对这些点进行验证，这样的结合会比较有效果。

　　Q：昨天看到说纳米孔测序技术的成本会有大幅降低，纳米孔测序会是未来的方向吗?

　　许：纳米孔测序会是未来的方向，但目前来说，在短时间内可能性会小一些，而且能拿到的数据量也是比较有限的。纳米孔测序肯定会是未来的方向，因此也需要更多的投入，如果可以做成，相信会带来整个测序的颠覆，包括现有的测序公司可能会有一个新的局面出来。

　　Q：面向C端的基因检测服务目前存在的最大问题是什么?

　　许：面向C端的基因检测服务目前存在的问题我想一个是价格，测的东西多了价格自然也就高了，基因检测服务还是属于比较高端的产品;第二个是大众的认知问题，检测出来是真正能够及时预防还是会造成恐慌，这个需要给消费者一定的时间;第三，最重要的还是技术层面的问题，基因检测服务到底能给大众带来什么，是否能真正预测未来的一些疾病，这是大家真正关心的。