感染性疾病常用的病原学检测

　　病原体的检测是临床确诊感染性疾病的主要手段，根据需要鉴定到一定水平即可。例如，作为临床病原学诊断，细菌感染只需鉴定到种，必要时才进一步鉴定；若进行流行病学调查，细菌鉴定应达到血清型或基因型。临床病原体检测必须通过采集标本，经过各种试验后才能明确诊断。标本采集质量的好坏直接影响诊断结果，早期采集、无菌采集、适当与适量采集是确保查明病原体的前提。临床病原体检测的方法有多种，包括涂片检测、分离培养、血清学鉴定和分子生物学诊断等，可根据临床需要和标本类型进行选择。临床标本分离培养的阳性结果最具确诊意义，但阴性结果并不能完全除外病原体感染的可能。病原体抗原成分检测可早期、快速诊断感染性疾病，阳性结果表明感染病原体的存在。分子生物学诊断为病原体感染的早期、快速、敏感、特异诊断成为可能，但应排除假阳性或假阴性结果。临床病原体检测的常用方法如下。

　　（一）细菌感染的检测

　　1.涂片检测  临床标本或分离培养物涂片直接或染色后光学显微镜观察，可为进一步做生化反应、血清学鉴定等提供参考依据。通过显微镜观察有无病原体及其大致数量，病原体形态、染色特征等，可以迅速作出初步诊断，如痰中的抗酸杆菌和脑脊液中的脑膜炎奈瑟菌等。

　　（1）不染色标本的检测：不染色标本一般用于观察细菌动力及运动情况，因为不染色标本直接在普通光学显微镜下，不能清楚看到细菌的形态与结构特征。细菌未染时呈无色透明，在显微镜下主要靠细菌的折光率与周围环境不同进行观察。有鞭毛的细菌在镜下呈活泼有方向的运动，无鞭毛的细菌则呈不规则布朗运动。常用的方法有压滴法、悬滴法和毛细管法。例如，在高倍暗视野显微镜下悬滴米泔样粪便，观察到来回穿梭似流星样运动的细菌；另制备一标本加入O1群霍乱弧菌诊断血清，若来回穿梭似流星样运动的细菌停止运动，为制动试验阳性，可报告疑为O1群霍乱弧菌。

　　（2）染色标本的检测：细菌标本经染色后，与周围环境在颜色上形成鲜明的对比，可在普通光学显微镜下清楚看到细菌的形态和某些结构。常用的细菌染色法有：①单染色法，只用一种染料将细菌和周围物体染成同一种颜色，称为单染色法。如吕氏亚甲蓝或稀释石炭酸复红染色法。细菌经单染色法处理后，可观察其形态与排列、大小及简单的结构，但不能显示细菌染色特性。②复染色法，用两种或两种以上的不同染料进行染色，可将不同细菌或同一细菌的不同结构染成不同的颜色。本法既可观察细菌的形态结构，还可根据染色反应及着色深浅鉴别细菌的种类，故又称鉴别染色法。常用的有革兰染色法（Gram stain）和抗酸染色法（Acid-fast stain）。

　　通过革兰染色，可将细菌分为革兰阳性（G+）和革兰阴牲（G-）两大类，有助于缩小范围、初步鉴定细菌。例如，在脑脊液涂片中发现G-的肾形、凹面相对的双球菌，且在吞噬细胞内或外，则可报告“脑脊液直接涂片找到革兰阴性双球菌，形似脑膜炎奈瑟菌”；若发现有革兰阳性双球菌，呈矛尖状、宽端相对尖端向外，且菌体周围有荚膜，则可报告“脑脊液直接涂片找到革兰阳性双球菌，形似肺炎链球菌”。

　　【评价】

　　该方法可以在第一时间内初步确定病原体，可把细菌分为革兰阳性（G+）和革兰阴性（G-）菌，以及发现一些特征性状明显的病原菌，如：脑膜炎奈瑟菌和肺炎链球菌等，有助于缩小范围、初步鉴定细菌，为临床治疗提供初步证据。因此是不可或缺的检验步骤。但是，由于其敏感性和特异性并不高，所以在临床上只作为初步筛查，最终的鉴定还需依靠生化或分子生物学方法。

　　2.分离培养与鉴定  采集临床标本在选择性或非选择性培养基分离培养，观察细菌的菌落形态、生化反应、毒素产生等，并用已知特异性抗体的免疫血清鉴定临床标本中或分离培养物中未知的细菌，确定致病菌的属、种和血清型（血清学鉴定）。　　

　　（1）分离培养：①增菌培养：由于标本中的细菌较少，用人工的方法提供生长繁殖所需的营养和最适条件，如温度、湿度和气体环境，使其迅速生长繁殖，使菌量增多，供进一步作纯培养或分离致病菌。大部分细菌在24～48h内培养生长良好。②分离培养：对于混有多种细菌的临床标本或其他培养物，经过划线接种到合适的选择性或非选择性固体培养基表面，因划线的分散作用，使许多原先混杂的细菌在固体培养基表面分离，一般经过18～24h培养后形成由一个细菌繁殖而来的细菌集团-菌落（colony），供细菌计数和纯培养用。挑选单个菌落，转种至另一培养基中，生长出来的细菌均为纯种，称为纯培养（pure culture）。分离纯培养是从临床标本中检测鉴定细菌非常重要的第一步，只有先从含有多种杂菌的标本中分离出目的菌纯培养，才能进一步对目的菌予以鉴定和研究。